Μελέτη της αποτελεσματικότητας και της επίδρασης συμβατικών και βιοπροστατευτικών προϊόντων στο μεταβολισμό του Colletotrichum acutatum, παθογόνου αιτίου του γλοιοσπορίου της ελιάς, με εφαρμογή μεταβολομικής

Abstract

Η παρούσα διπλωματική εργασία είχε ως αντικείμενο τη διερεύνηση της αποτελεσματικότητας συμβατικών δραστικών ουσιών και βιοπροστατευτικών προϊόντων (ωφέλιμα βακτήρια) έναντι στελεχών του σύμπλοκου είδους Colletotrichum acutatum, του παθογόνου αιτίου της πιο καταστρεπτικής μυκητολογικής ασθένειας της ελιάς, του γλοιοσπορίου. Στο πλαίσιο αυτό, πραγματοποιήθηκε απομόνωση και μοριακή ταυτοποίηση του παθογόνου από προσβεβλημένους ελαιόκαρπους που συλλέχθηκαν από ελαιώνες του Αγροτικού Ελαιουργικού Συνεταιρισμού (ΑΕΣ) «Νηλέας» (Π.Ε. Μεσσηνίας). Αρχικά, αξιολογήθηκε η παθογόνος ικανότητα επιλεγμένων στελεχών του παθογόνου σε ώριμους και άγουρους καρπούς των ποικιλίων «Καλαμών» και «Κορωνέικη» αντίστοιχα, όπου τα στελέχη διαφοροποιήθηκαν αισθητά, με το PLS 1261 να ξεχωρίζει εμφανίζοντας την υψηλότερη παθογόνο ικανότητα. Η παρουσία νύγματος επιτάχυνε την εξέλιξη της ασθένειας, ενώ στην περίπτωση των άγουρων καρπών ήταν απαραίτητη για την έναρξη της. Παράλληλα, μελετήθηκε in vitro η ευαισθησία των στελεχών αυτών σε εγκεκριμένες δραστικές ουσίες της κατηγορίας των στρομπιλουρινών και των τριαζολικών. Η βιοδοκιμή αυτή ανέδειξε κυμαινόμενη αποτελεσματικότητα μεταξύ των δραστικών ουσίων, με τις στρομπιλουρίνες pyraclostrobin και trifloxystrobin να εμφανίζουν την υψηλότερη αποτελεσματικότητα, ενώ αντίθετα το kresoxim-methyl ήταν το πλέον αναποτελεσματικό. Το στέλεχος PLS 1261 διαφοροποιήθηκε ξανά, παρουσιάζοντας μειωμένη ευαισθησία στις στρομπιλουρίνες trifloxystrobin, azoxystrobin και kresoxim-methyl. Στη συνέχεια, επιλεγμένα βακτηριακά στελέχη Bacillus spp. και Pseudomonas spp. αξιολογήθηκαν in vitro ως προς την ανταγωνιστική τους δράση έναντι στελεχών του παθογόνου και ως προς την ικανότητα παραγωγής υδρολυτικών ενζύμων. Τα στελέχη PLS 591 (Bacillus sp.) και PLS 805 (Pseudomonas sp.) ξεχώρισαν ως οι πλέον αποτελεσματικοί παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης εμφανίζοντας ικανοποιητικά ποσοστά παρεμπόδισης της μυκηλιακής ανάπτυξης και ένα ισχυρό ενζυμικό οπλοστάσιο. Παράλληλα, το στέλεχος PLS 1261 χαρακτηρίστηκε ως λιγότερο ευαίσθητο στην ανταγωνιστική δράση των στελεχών Pseudomonas spp. Η μελέτη ολοκληρώθηκε με τη διερεύνηση της επίδρασης τριών στρομπιλουρινών και δυο βακτηριακών στελεχών στον μεταβολισμό του στελέχους PLS 1261, μέσω GC/EI/MS μεταβολομικής ανάλυσης. Παρουσία των στρομπιλουρινών, τα δεδομένα αναδεικνύουν την αναδιοργάνωση του κεντρικού μεταβολισμού του παθογόνου, με το pyraclostrobin να επιφέρει εντονότερη μεταβολική απόκριση με αύξηση των επιπέδων μεταβολιτών που σχετίζονται με μηχανισμούς απόκρισης στο stress (L-proline, erythritol), διαταραχή του TCA αλλά και του μεταβολισμού της L-lysine. Η δραστική ουσία trifloxystrobin συσχετίστηκε κατά κύριο λόγω με μεταβολές στον λιπιδικό μεταβολισμό του παθογόνου αλλά και με την διαταραχή του μεταβολισμού της L-lysine, ενώ η δραστική ουσία kresoxim-methyl είχε ηπιότερη επίδραση στο μεταβολικό προφίλ του παθογόνου. Η συγκαλλιέργεια με το στέλεχος PLS 591 προκάλεσε τροποποίηση του ενεργειακού μεταβολισμού του παθογόνου, με πιθανές ενδείξεις ενεργοποίησης του glyoxylate cycle, ενώ οδήγησε και στην αύξηση μεταβολιτών όπως η L-proline και η erythritol, υποδηλώνοντας την προσαρμοστική ικανότητα του παθογόνου σε συνθήκες stress. Όσον αφορά το στέλεχος PLS 805, η παρουσία του δεν τροποποίησε τόσο έντονα τον TCA αλλά παρατηρήθηκαν μεταβολές στο μονοπατι των πολυαμινών (L-ornithine, putrescine, spermidine), υποδηλώνοντας διαταραχή της κυτταρικής ισορροπίας. Συνολικά, τα αποτελέσματα της μελέτης αναδεικνύουν την διαφορετική επίδραση των συμβατικών και βιολογικών παραγόντων στο μεταβολισμό και στη φυσιολογία ενός στελέχους του παθογόνου με υψηλή προσαρμοστικότητα (μειωμένη ευαισθησία σε στρομπιλουρίνες – υψηλή παθογόνος ικανότητα), ενώ παράλληλα υπογραμμίζουν την δυναμική των ωφέλιμων βακτηρίων για την ανάπτυξη βιοπροστατευτικών προϊόντων στο πλαίσιο της πράσινης μετάβασης και της βιώσιμης φυτοπροστασίας των καλλιεργειών.Abstract The purpose of this study was to investigate the efficacy of conventional fungicides (active substances) and microbial biopesticides (beneficial bacterial isolates) against isolates of the Colletotrichum acutatum species complex, the causal agent of olive anthracnose, the most destructive fungal disease affecting olives. In this context, the pathogen was isolated and molecularly identified from infected olive fruits collected from olive groves belonging to the Agricultural Olive Oil Cooperative “Nileas” (Prefecture of Messinia). Initially, the pathogenicity of selected isolates was evaluated on ripe and immature fruits of “Kalamon” and “Koroneiki” cultivars, respectively. The isolates showed significant differences, with isolate PLS 1261 exhibiting the highest pathogenicity. The presence of artificial wounds accelerated the disease progression, while it was necessary for disease initiation in immature fruits. At the same time, the sensitivity of these isolates to authorized active substances from the QoI and DMI classes was assessed in vitro. The results demonstrated variability in efficacy among the tested substances. Pyraclostrobin and trifloxystrobin were the most effective, whereas kresoxim-methyl showed the lowest efficacy. Notably, isolate PLS 1261 stood out yet again, exhibiting reduced sensitivity to trifloxystrobin, azoxystrobin and kresoxim-methyl (QoIs). Subsequently, selected bacterial isolates belonging to Bacillus spp. and Pseudomonas spp. were evaluated in vitro for their antagonistic activity against the pathogen, as well as for their ability to produce hydrolytic enzymes. Isolates PLS 591 (Bacillus sp.) and PLS 805 (Pseudomonas sp.) emerged as the most effective biological control agents, showing substantial inhibition of the mycelial growth, along with strong enzymatic activity. However, isolate PLS 1261 exhibited reduced sensitivity to the antagonistic effect of the Pseudomonas spp. isolates. The study concluded with an investigation of the effect of three QoI active substances and two bacterial isolates on the metabolism of isolate PLS 1261, applying GC/EI/MS-based metabolomic analysis. In the presence of QoIs, the pathogen appears to be reorganizing its central metabolism. Pyraclostrobin induced a more extensive metabolic response, characterized by increased levels of metabolites associated with stress response (L-proline, erythritol), disruption of the TCA cycle and alterations in L-lysine biosynthesis. Trifloxystrobin was primarily associated with changes in lipid metabolism and also affected the L-lysine biosynthesis, whereas kresoxim-methyl had a comparatively milder impact on the metabolic profile of isolate PLS 1261. Co-cultivation with isolate PLS 591 resulted in alterations in the energy metabolism of the pathogen, with indications of activation of the glyoxylate cycle, along with increased levels of metabolites such as L-proline and erythritol, suggesting adaptive responses to stress. In contrast, co-cultivation with isolate PLS 805 didn’t affect the TCA cycle significantly, it did alter however the polyamine biosynthesis pathway (L-ornithine, putrescine, spermidine), indicating a disruption of cellular homeostasis. Overall, the findings highlight the distinct effect of conventional fungicides and biopesticides on the metabolism and physiology of an adaptable isolate of the pathogen characterized by high pathogenicity and reduced sensitivity to strobilurins. Furthermore, the results underscored the potential of beneficial bacteria in the development of biopesticides, supporting the transition toward sustainable and environmentally friendly crop protection strategies.