Μελέτη απόκρισης μεμονωμένων κυττάρων Listeria monocytogenes μετά από έκθεση σε απολυμαντικό Benzalkonium chloride με χρήση φθορισιομετρικών τεχνικών και μικροσκοπίας

Abstract

Η Listeria monocytogenes αποτελεί έναν από τους πιο σημαντικούς τροφιμογενείς παθογόνους μικροοργανισμούς που προκαλούν σοβαρές επιπτώσεις στη δημόσια υγεία, γεγονός που καθιστά αναγκαία την ανάπτυξη και την εφαρμογή αποτελεσματικών μεθόδων απολύμανσης στη βιομηχανία τροφίμων. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της δυναμικής απόκρισης της L. monocytogenes σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων κατά την έκθεση της σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του απολυμαντικού Benzalkonium Chloride (BAC) που χρησιμοποιείται ευρέως στη βιομηχανία. Για τον σκοπό αυτό, έγινε χρήση μικροσκοπίας φθορισμού σε συνδυασμό με διπλή χρώση των κυττάρων. Χρησιμοποιήθηκε μετασχηματισμένο στέλεχος του μικροοργανισμού με πλασμίδιο GFP που σηματοδοτεί τη μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων και ταυτόχρονα χρωστική Propidium Iodide (PI) που συνεπάγεται με διαταραγμένη μεμβράνη και απώλεια βιωσιμότητας τους. Η μέθοδος αυτή επιτρέπει τη διάκριση των κυττάρων σε μεταβολικά ενεργά κύτταρα (GFP+/PI-), ενδιάμεσες φυσιολογικές καταστάσεις (GFP+/PI+) και μη βιώσιμα κύτταρα (GFP+/PI+). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δράση του απολυμαντικού είναι άμεσα εξαρτημένη τόσο από την συγκέντρωση που εφαρμόζεται, όσο και από τον χρόνο εφαρμογής. Στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις (23 και 38ppm), παρατηρήθηκε σταδιακή μετάβαση των κυττάρων από τις φυσιολογικές καταστάσεις, ενώ στη συγκέντρωση 100ppm η απενεργοποίηση τους επιταχύνθηκε σημαντικά. Στις υψηλότερες συγκεντρώσεις (≥200ppm) επιτεύχθηκε ταχεία εξάλειψη των μεταβολικά ενεργών κυττάρων εντός της πρώτης ώρας έκθεσης. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η εμφάνιση και η δυναμική των διπλά χρωσμένων κυττάρων, τα οποία αντιστοιχούν σ’ ένα μεταβατικό στάδιο μεταξύ βιωσιμότητας και θανάτου. Η εμφάνιση αυτών των ενδιάμεσων φαινοτύπων υποδεικνύει ότι η απενεργοποίηση των κυττάρων δεν είναι στιγμιαία, αλλά συμβαίνει μέσω σταδιακής αποδιοργάνωσης της κυτταρικής μεμβράνης και της μεταβολικής δραστηριότητας. Παράλληλα, παρατηρήθηκε φαινοτυπική ετερογένεια η οποία μπορεί να αποδοθεί στη διαφορετική απόκριση, που μπορεί να εμφανίζουν τα μεμονωμένα κύτταρα, λόγω είτε ανθεκτικότητας που μπορεί να διαθέτουν είτε από την επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων, όπως η θερμοκρασία. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αναδεικνύουν την πολυπλοκότητα της μικροβιακής απόκρισης στο Benzalkonium Chloride και υπογραμμίζουν τη σημασία της ανάλυσης σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων για να εκτιμηθεί με μεγαλύτερη ακρίβεια η αποτελεσματικότητα των απολυμαντικών. Η κατανόηση των ενδιάμεσων αυτών καταστάσεων και της ετερογένειας τους είναι κρίσιμη για τον σχεδιασμό πιο αποτελεσματικών στρατηγικών απολύμανσης και τη διασφάλιση της ασφάλειας των τροφίμων.Abstract Listeria monocytogenes is one of the most significant foodborne pathogens, causing serious public health consequences, making it necessary to develop and implement effective disinfection methods in the food industry. The aim of this study was to investigate the dynamic response of L. monocytogenes at the single-cell level upon exposure to different concentrations of the disinfectant benzalkonium chloride (BAC), which is widely used in the industry. For this purpose, fluorescence microscopy was used in combination with dual staining of the cells. A transformed strain of the microorganism was used, carrying a GFP plasmid that indicates cellular metabolic activity, along with the dye Propidium Iodide (PI), which is associated with membrane disruption and loss of viability. This method allows for the differentiation of cells into metabolically active cells (GFP+/PI-), intermediate physiological states (GFP+/PI+), and non-viable cells (GFP+/PI+). The results showed that the disinfectant’s action is directly dependent on both the concentration applied and the duration of exposure. At the lowest concentrations (23 and 38 ppm), a gradual transition of the cells from their normal states was observed, while at a concentration of 100 ppm, their inactivation was significantly accelerated. At the highest concentrations (≥200 ppm), rapid elimination of metabolically active cells was achieved within the first hour of exposure. Of particular interest is the appearance and dynamics of double-stained cells, which correspond to a transitional stage between viability and death. The appearance of these intermediate phenotypes indicates that cell inactivation is not instantaneous but occurs through a gradual disorganization of the cell membrane and metabolic activity. At the same time, phenotypic heterogeneity was observed, which can be attributed to the different responses that individual cells may exhibit due to either inherent resistance or the influence of environmental factors, such as temperature. Overall, the results of this study highlight the complexity of the microbial response to benzalkonium chloride and underscore the importance of single-cell analysis to more accurately assess the efficacy of disinfectants. Understanding these intermediate states and their heterogeneity is critical for designing more effective disinfection strategies and ensuring food safety.