Λειτουργική ανάλυση των μηχανισμών ανθεκτικότητας των εχθρών καλλιεργειών στα εντομοκτόνα, με έμφαση στις κυτοχρωμικές οξειδάσες P450 (cytochrome P450s)

Abstract

Η εκτεταμένη χρήση εντομοκτόνων και ακαρεοκτόνων στη γεωργία έχει οδηγήσει στην εμφάνιση ανθεκτικότητας σε πολλά επιβλαβή αρθρόποδα, περιορίζοντας σταδιακά την αποτελεσματικότητα των διαθέσιμων χημικών μέσων. Η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που σχετίζονται με τo φαινόμενo της ανθεκτικότητας είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη αποτελεσματικότερων στρατηγικών διαχείρισης κι αντιμετώπισης του φαινομένου. Η παρούσα διατριβή εξετάζει το ρόλο των κυτοχρωμικών οξειδασών P450 στην ανάπτυξη της ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα και ακαρεοκτόνα σε τρία είδη αρθροπόδων με σημαντικές οικονομικές επιπτώσεις για τη γεωργία και τη μελισσοκομία: τον τετράνυχο Tetranychus urticae, τον δάκο της ελιάς Bactrocera oleae και το παρασιτικό άκαρι της μέλισσας Varroa destructor. Επιλεγμένα γονίδια των κυτοχρωμικών οξειδασών P450 εκφράστηκαν ετερόλογα σε βακτήρια E. coli, προκειμένου να διερευνηθεί in vitro η ικανότητα των αντίστοιχων ενζύμων να μεταβολίζουν εντομοκτόνα και ακαρεοκτόνα, ενώ στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση των παραγόμενων μεταβολιτών. Στον τετράνυχο Tetranychus urticae η λειτουργική ανάλυση των κυτοχρωμικών οξειδασών P450 CYP392A16, CYP392A11, CYP392D8 και CYP392D2 έδειξε ότι τα ένζυμα αυτά μπορούν να μεταβολίζουν ακαρεοκτόνα διαφορετικών χημικών ομάδων, όπως τα pyflubumide, bifenazate, amitraz, chlorfenapyr, pyridaben και etoxazole. Στο δάκο της ελιάς Bactrocera oleae διαπιστώθηκε ότι οι κυτοχρωμικές οξειδάσες P450 CYP6G6, CYP6G28, CYP6A61 και CYP4P6 συμμετέχουν στον μεταβολισμό πυρεθροειδών. Στο παρασιτικό άκαρι της μέλισσας Varroa destructor η κυτοχρωμική οξειδάση P450 CYP3002B2 βρέθηκε να μεταβολίζει τα ακαρεοκτόνα amitraz και flumethrin. Συνολικά, η διατριβή παρέχει in vitro λειτουργικά δεδομένα για τον ρόλο επιλεγμένων κυτοχρωμικών οξειδασών P450 στον μεταβολισμό εντομοκτόνων και ακαρεοκτόνων σε τρία σημαντικά είδη επιβλαβών αρθροπόδων και συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση της μεταβολικής ανθεκτικότητας. Τα δεδομένα αυτά συμβάλλουν στην αναγνώριση κυτοχρωμικών οξειδασών P450 που σχετίζονται με τη μεταβολική ανθεκτικότητα και μπορούν να υποστηρίξουν την επιλογή υποψήφιων μοριακών δεικτών για την ανάπτυξη διαγνωστικών εργαλείων ανίχνευσης και παρακολούθησής του φαινομένου. Επιπλέον, η εργασία οδήγησε στη δημιουργία βιβλιοθηκών ανασυνδυασμένων κυτοχρωμικών οξειδασών P450, οι οποίες μπορούν να αξιοποιηθούν σε μελλοντικές μελέτες για την αξιολόγηση νέων δραστικών ουσιών και πιθανών αναστολέων των ενζύμων αυτών, συμβάλλοντας στον σχεδιασμό βελτιωμένων σκευασμάτων με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα έναντι ανθεκτικών πληθυσμών. Με τον τρόπο αυτό, τα δεδομένα της διατριβής μπορούν να συμβάλουν σε πιο τεκμηριωμένες στρατηγικές διαχείρισης της ανθεκτικότητας.

The extensive use of insecticides and acaricides in agriculture has led to the emergence of resistance in many harmful arthropods, gradually reducing the effectiveness of the available chemical control tools. Understanding the molecular mechanisms associated with resistance is essential for the development of more effective strategies for its management and control. This thesis investigates the role of cytochrome P450 enzymes in the development of resistance to insecticides and acaricides in three arthropod species with major economic importance for agriculture and apiculture: the two-spotted spider mite Tetranychus urticae, the olive fruit fly Bactrocera oleae, and the parasitic honeybee mite Varroa destructor. Selected cytochrome P450 genes were heterologous expressed in E. coli in order to examine in vitro the ability of the corresponding enzymes to metabolize insecticides and acaricides. The resulting metabolites were subsequently identified. In Tetranychus urticae, functional analysis of the cytochrome P450 enzymes CYP392A16, CYP392A11, CYP392D8, and CYP392D2 showed that these enzymes can metabolize acaricides belonging to different chemical classes, including pyflubumide, bifenazate, amitraz, chlorfenapyr, pyridaben, and etoxazole. In Bactrocera oleae, the cytochrome P450 enzymes CYP6G6, CYP6G28, CYP6A61, and CYP4P6 were found to participate in the metabolism of pyrethroids. In Varroa destructor, the cytochrome P450 enzyme CYP3002B2 was shown to metabolize the acaricides amitraz and flumethrin. Overall, this thesis provides in vitro functional data on the role of selected cytochrome P450 enzymes in the metabolism of insecticides and acaricides in three important arthropod pests and contributes to a better understanding of metabolic resistance. These data help identify cytochrome P450 enzymes associated with metabolic resistance and may support the selection of candidate molecular markers for the development of diagnostic tools aimed at detecting and monitoring this phenomenon. In addition, this work led to the development of recombinant cytochrome P450 libraries, which can be used in future studies to evaluate new active ingredients and potential inhibitors of these enzymes, contributing to the design of improved formulations with greater effectiveness against resistant populations. In this way, the findings of this thesis may support more evidence-based resistance management strategies.