Ρύθμιση της ομοιόστασης σιδήρου στον αραβόσιτο

Abstract

Ο σίδηρος (Fe) είναι απαραίτητο ιχνοστοιχείο για την ομαλή ανάπτυξη και παραγωγικότητα των φυτών, ενώ η φυτική ύλη αποτελεί βασική πηγή για την κάλυψη των αναγκών, τόσο του ανθρώπου όσο και των ζώων, σε σίδηρο. Ωστόσο, παρά τη σημαντικότητά του και τον μεγάλο αριθμό μελετών που αφορούν στους μηχανισμούς πρόσληψής του από τα φυτά, πολύ λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με τις μορφολογικές και ανατομικές μεταβολές που υφίσταται το ριζικό σύστημα υπό συνθήκες ανεπαρκούς θρέψης με Fe, ή για την οργάνωση των -Fe αποκρίσεων κατά μήκος των ριζών. Ακόμα, παρότι ο αραβόσιτος περιγράφεται ως φυτό που ακολουθεί αποκλειστικά τη Στρατηγική ΙΙ για την πρόσληψη του σιδήρου, η παρουσία γονιδίων της Στρατηγικής Ι στο γονιδίωμά του αφήνει ανοιχτό το ενδεχόμενο της ύπαρξης εναλλακτικών μηχανισμών απορρόφησης σιδήρου. Έτσι, η παρούσα διδακτορική διατριβή εστίασε στο πεδίο της ρύθμισης της ομοιόστασης του σιδήρου στον αραβόσιτο (Zea mays L.) που αφορά στις μορφολογικές, φυσιολογικές, και μοριακές αποκρίσεις του φυτού στην έλλειψη του θρεπτικού αυτού, καθώς επίσης και στην επίδραση των γιββερελλινών στην εκδήλωση της -Fe απόκρισης. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στην φαινοτυπική ανάλυση και τη μελέτη των μορφολογικών προσαρμογών του ριζικού συστήματος στην έλλειψη σιδήρου, ενώ ακόμα διερευνήθηκε η χωρικότητα των -Fe αποκρίσεων σε μοριακό και φυσιολογικό επίπεδο κατά μήκος των βλαστογενών ριζών, ώστε να διαπιστωθεί αν η απόκριση στην έλλειψη Fe είναι ομοιόμορφη ή διαφέρει μεταξύ της περιοχής της ρίζας που φέρει πλάγιες ρίζες και του ακρορριζίου. Για τον σκοπό αυτό, αρτίβλαστα αραβοσίτου αναπτύχθηκαν σε κατάλληλο υδροπονικό σύστημα σε δύο επίπεδα θρέψης με σίδηρο (επάρκεια ή ανεπάρκεια Fe), ενώ επιπροσθέτως πραγματοποιήθηκαν χειρισμοί είτε με εφαρμογή εξωγενούς GA₃ είτε με προσθήκη του παρεμποδιστή της βιοσύνθεσης γιββερελλινών, mepiquat chloride. Δειγματοληψίες πραγματοποιήθηκαν τόσο βραχυπρόθεσμα (2 ημέρες από την έναρξη των μεταχειρίσεων), όσο και μακροπρόθεσμα (7 ημέρες μετά την έναρξη των μεταχειρίσεων), στο πλαίσιο των οποίων διενεργήθηκαν μετρήσεις και προσδιορισμοί που αφορούσαν τον φαινότυπο του υπέργειου τμήματος και του ριζικού συστήματος, την ποσοτικοποίηση των εναποθέσεων Fe3+ και του σχηματισμού Fe2+ στην επιφάνεια των βλαστογενών ριζών, και την εξέταση της γονιδιακής έκφρασης γονιδίων που συμμετέχουν στη βιοσύνθεση φυτοσιδηροφόρων, στην πρόσληψη Fe, στην αποθήκευση, και στη ρύθμιση της ομοιόστασης του σιδήρου. Η πειραματική διαδικασία πλαισιώθηκε από βιοπληροφορική ανάλυση για τη μελέτη δύο γενετικών τόπων του αραβοσίτου που έχουν συσχετιστεί με τον φαινότυπο της ρίζας και την ομοιόσταση του Fe, όπως επίσης και για την ανάδειξη νέων, υποψήφιων ρυθμιστών της ομοιόστασης του σιδήρου, και για την ταυτοποίηση εγγύς στοιχείων (cis-elements) στους υποκινητές των υπό εξέταση γονιδίων. Όπως αναμενόταν, η ανεπάρκεια σιδήρου επηρέασε δραστικά τον φαινότυπο των φυτών. Το υπέργειο μέρος παρουσίασε έντονη, χαρακτηριστική χλώρωση με έμφαση στα νεότερα φύλλα, ενώ ακόμα παρατηρήθηκε μειωμένη συσσώρευση βιομάζας. Στο ριζικό σύστημα, η ανεπάρκεια Fe επηρέασε το μήκος και τον ρυθμό της επιμήκυνσης των ριζών, και οδήγησε στην εμφάνιση πλάγιων ριζών σε μεγαλύτερη εγγύτητα προς το κορυφαίο μερίστωμα της ρίζας, μειώνοντας έτσι σημαντικά το μήκος του ακρορριζίου. Ο φαινότυπος αυτός στον αραβόσιτο ονομάζεται BTR (Branching at the Terminal 5 centimeters of the Root) και έχει συνδεθεί με τον γενετικό τόπο “chrom7-glb1”. Αντίστοιχα, ο γενετικός τόπος “jpsb79-umc60” εμπλέκεται στην εκδήλωση ενός άλλου -Fe φαινοτύπου της ρίζας, αυτόν της μείωσης του μήκους της. η βιοπληροφορική μελέτη των δύο αυτών γενετικών τόπων ανέδειξε τη σηματοδότηση των γιββερελλινών ως κόμβο μεταξύ της ρύθμισης της ομοιόστασης του Fe και των μορφοανατομικών μεταβολών που υφίσταται η ρίζα κατά την έλλειψη σιδήρου. Ως εκ τούτου, η εξωγενής εφαρμογή GA₃, ακόμη και σε φυτά με επαρκή θρέψη με Fe, προκάλεσε φαινοτυπικές και μοριακές μεταβολές που προσομοίαζαν εκείνες της σιδηροπενίας, ενώ η παρεμπόδιση της βιοσύνθεσης των γιββερελλινών περιόρισε την ένταση των αντίστοιχων φαινοτύπων, υπό έλλειψη σιδήρου. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν ότι οι γιββερελλίνες αποτελούν ουσιώδες τμήμα του μηχανισμού μέσω του οποίου ο αραβόσιτος αποκρίνεται στη μειωμένη διαθεσιμότητα σιδήρου. Σε επίπεδο φυσιολογίας, προέκυψε ότι η απόκριση στην ανεπάρκεια σιδήρου εμφανίζει σαφή χωρική οργάνωση κατά μήκος της ρίζας. Πιο συγκεκριμένα, οι αποκρίσεις της περιοχής της ρίζας που φέρει πλάγιες ρίζες φαίνεται να αντανακλούν πρωτίστως τη θρεπτική κατάσταση ολόκληρου του φυτού ως σύστημα, ενώ οι μεταβολές στο ακρορρίζιο διαμορφώνονται περισσότερο από τις τοπικές απαιτήσεις για Fe, και οι οποίες σε μεγάλο βαθμό απορρέουν από τον μεταβολισμό του ακρορριζίου και την ανάπτυξη της ρίζας. Παράλληλα, πέραν του φαινοτύπου και της φυσιολογίας του φυτού διαπιστώθηκε ότι οι γιββερελλίνες εμπλέκονται στη ρύθμιση της πρόσληψης σιδήρου μέσω της Στρατηγικής ΙΙ, καταστέλλοντας τη βιοσύνθεση φυτοσιδηροφόρων και επηρεάζοντας αρνητικά τη μεταφορά του Fe από τη ρίζα προς το υπέργειο μέρος, γεγονός που οδηγεί στη συσσώρευσή του στις ρίζες και στην ταυτόχρονη εκδήλωση ανεπάρκειας σιδήρου στον βλαστό. Τέλος, προέκυψαν σημαντικές ενδείξεις για την ύπαρξη λειτουργικού μηχανισμού απορρόφησης δισθενούς σιδήρου στον αραβόσιτο, ο οποίος φαίνεται να ενεργεί παράλληλα με την πρόσληψη τρισθενούς σιδήρου μέσω της Στρατηγικής II. Η διαπίστωση του σχηματισμού Fe2+ στην επιφάνεια της ρίζας, σε συνδυασμό με τη μελέτη των παραλόγων μεταφορέων δισθενούς σιδήρου ZmIRT1 και ZmIRT2, ενισχύει την άποψη ότι η πρόσληψη σιδήρου στον αραβόσιτο είναι πιο περίπλοκη απ’ ότι θεωρούνταν και δεν περιορίζεται μόνο στη Στρατηγική ΙΙ. Συνολικά, η παρούσα διατριβή παρέχει μια διεξοδική περιγραφή του -Fe φαινοτύπου στον αραβόσιτο, ενώ συμβάλλει στην πληρέστερη κατανόηση των μηχανισμών πρόσληψης σιδήρου μέσω της αποσαφήνισης της οργάνωσης της -Fe απόκρισης κατά μήκος της ρίζας, καθώς και της ανάδειξης εναλλακτικής οδού απορρόφησης Fe2+. Ακόμα, καταδεικνύει τον σημαντικό ρόλο των γιββερελλινών στη ρύθμιση της ομοιόστασης του σιδήρου, τόσο σε φαινοτυπικό, όσο και σε μοριακό επίπεδο, ενώ η βιοπληροφορική ανάλυση που διενεργήθηκε ταυτοποίησε νέους ρυθμιστές με ενδεχόμενη εμπλοκή στο δίκτυο ρύθμισης της ομοιόστασης Fe.Abstract Iron (Fe) is an essential micronutrient for plant growth and productivity, and plant biomass constitutes a major dietary source of iron for both humans and animals. Despite the importance of Fe and the extensive body of work on the mechanisms governing its uptake by plants, much less is known about the morphological and anatomical alterations that the root system undergoes under conditions of insufficient Fe supply, or about the spatial organization of Fe-deficiency responses along the root axis. Moreover, although maize is classically described as a Strategy II species in terms of iron acquisition, the presence of Strategy I-related genes in its genome suggests that alternative Fe uptake mechanisms may also operate in this species. Within this framework, this study focused on the regulation of iron homeostasis in maize (Zea mays L.), with particular emphasis on the morphological, physiological, and molecular responses to Fe deficiency, as well as on the effect of gibberellins on the regulation of the -Fe response. In parallel, the spatial organization of Fe acquisition and its regulation was investigated at both the molecular and physiological levels along crown roots. Maize seedlings were grown hydroponically under two distinct Fe nutritional regimes (Fe sufficiency or insufficiency). In addition, plants were treated either with exogenous GA₃ or with mepiquat chloride, a gibberellin biosynthesis inhibitor. Samplings were carried out both short-term (2 days after treatment initiation) and long-term (7 days after treatment initiation). The analyses performed included a comprehensive plant phenotyping, the quantification of Fe³⁺ depositions and Fe²⁺ formation on the root surface, and the expression analysis of genes involved in phytosiderophore biosynthesis, Fe uptake, Fe storage, and the regulation of iron homeostasis. The experimental work was further complemented by a bioinformatic study aiming to investigate two maize genetic loci linking iron homeostasis and the root phenotype, as well as to identify novel candidate regulators of iron homeostasis and to detect cis-element motifs in the promoters of selected genes of interest. As expected, the plant phenotype was strongly affected by Fe deficiency. A characteristic chlorosis, particularly in the younger leaves, was evident in the shoot, while biomass accumulation was also significantly reduced. In the root system, Fe deficiency affected both root length and root elongation rate and promoted the ectopic emergence of lateral roots in greater proximity to the root tip. In maize, this phenotype is referred to as BTR (Branching at the Terminal 5 centimeters of the Root) and has been associated with the genetic locus “chrom7-glb1”. In addition, the locus “jpsb79-umc60” has been implicated in the reduced root length observed under iron starvation. The in silico examination of these two loci pointed to gibberellin signaling as a key link between the regulation of Fe homeostasis and the morphological and anatomical modifications which occur in the root under Fe deficiency. In agreement, the exogenous application of GA₃ even in plants grown under iron sufficiency induced phenotypic and molecular changes resembling Fe deficiency, whereas inhibition of gibberellin biosynthesis attenuated the severity of these phenotypes irrespectively of Fe supply. Taken together, these findings strongly suggest that GA signaling is an integral component of the Fe deficiency response in maize. At the physiological level, the response to iron deficiency was found to be differentially organized in distinct root sectors. More specifically, responses occurring in the lateral root sector primarily reflect the Fe status of the plant at the systemic level, whereas perturbations in the root apex are strongly shaped by local Fe demands. Moreover, in addition to their effect on plant phenotype and physiology, gibberellins were also found to participate in the regulation of Strategy II-mediated Fe acquisition, by repressing phytosiderophore biosynthesis and negatively affecting Fe translocation from root to shoot. This, in turn, leads to Fe accumulation in the roots and the development of Fe deficiency in the shoot. Finally, the study provided important evidence for the existence of a functional ferrous iron uptake mechanism in maize, apparently operating in parallel with ferric iron acquisition via Strategy II. The detection of Fe²⁺ formation at the root surface, together with the analysis of the ferrous iron transporter paralogs ZmIRT1 and ZmIRT2, strengthens the view that iron uptake in maize is more complex than previously thought and is not restricted to Strategy II alone. Overall, this study provides a comprehensive description of the -Fe phenotype in maize while also contributing to a more holistic understanding of iron acquisition mechanisms by examining the organization of the -Fe response along different root sectors, as well as by providing evidence of a ferric iron uptake pathway, operating in conjunction with Strategy II. It further demonstrates the involvement of gibberellins in the regulation of iron homeostasis at both the phenotypic and molecular levels, while the bioinformatic analyses conducted identified novel regulators with putative roles in the iron homeostasis regulatory network.